生物堿類成分分析：性質(zhì)、定性與定量!
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在現(xiàn)代分析檢測領域，生物堿類成分的分析一直是科研與質(zhì)量控制的關鍵環(huán)節(jié)。作為一家專業(yè)的分析檢測機構，我們深知生物堿類成分在藥物研發(fā)、中藥質(zhì)量控制以及天然產(chǎn)物研究中的重要性。生物堿，這一類廣泛存在于植物界的含氮有機化合物，因其獨特的理化性質(zhì)和多樣的生物活性，一直是科學研究的熱點。從其復雜的理化特性到精準的定性與定量分析，每一個環(huán)節(jié)都對檢測技術提出了極高的要求。下面小編將深入探討生物堿類成分的理化性質(zhì)、定性分析方法以及定量分析技術，為相關領域的研究者和從業(yè)者提供全面而深入的參考，助力精準檢測與質(zhì)量把控。
一、理化性質(zhì)
1、性狀
多數(shù)生物堿為結晶形固體，少數(shù)為非晶形粉末(如烏頭原堿)?，極少數(shù)小分子生物堿為液體(如煙堿、毒芹堿等)?。生物堿一般為無色或白色，如結構中具有較長共軛體系，并有助色團，或同時為離子型化合物時可顯不同顏色(如小檗堿、木蘭花堿為黃色，血根堿的鹽為紅色)?。生物堿多具有苦味、個別也有其他味道(如甜味、辛味等)?。少數(shù)液態(tài)及小分子固體生物堿具揮發(fā)性，個別生物堿還具有升華性。
2.旋光性
含有手性碳原子或本身為手性分子的生物堿具有旋光性，多為左旋。一般左旋的生物堿具有較強的生物活性，而右旋體的生物活性則無或極弱。
3、溶解性
生物堿的溶解性與其結構中的氮原子的存在狀態(tài)、官能團極性大小、數(shù)目及溶劑等因素有關。游離生物堿極性較小，難溶或不溶于水，可溶于乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑;生物堿的鹽極性較大，大多易溶于水和醇，難溶或不溶于乙醚、苯、三氯甲烷等;季銨類生物堿極性較大，易溶于水;小分子生物堿和液體生物堿也易溶于水，如麻黃堿、煙堿等。某些結構中含有羧基、酚羥基等酸性基團的生物堿還能溶于堿性溶液中;若分子中存在內(nèi)酯環(huán)結構，在堿水中內(nèi)酯環(huán)開裂、成鹽而溶解，加酸又能析出。
4、沉淀反應
在酸性水溶液中可以與生物堿反應生成不溶于水的復鹽或分子絡合物的試劑稱為生物堿沉淀試劑。生物堿沉淀試劑可用于生物堿類成分的定性鑒別，當某些沉淀試劑與生物堿生成的沉淀組成穩(wěn)定時，還可用于生物堿類成分的含量測定。
5、堿性
生物堿因其分子中氮原子上的孤對電子能接受質(zhì)子而顯堿性，能與酸反應成鹽。生物堿的堿性強弱與氮原子的存在狀態(tài)和雜化方式有關，堿性的p Ka值大小順序一般是：胍類>季銨堿>脂肪胺>芳雜環(huán)(吡啶)>酰胺類。通常情況下，氮原子的雜化度越高堿性越強，即sp3>sp2>sp1.一般堿性強的生物堿在植物體中多與植物中的有機酸結合成鹽，以鹽的形式存在;而堿性很弱的生物堿，則以游離狀態(tài)存在。
6、顯色反應
許多生物堿能與一些試劑如Mandelin試劑(1%釩酸銨的濃硫酸溶液)?、Frohde試劑(1%鉬酸鈉或5%鉬酸銨的濃硫酸溶液)和Macrquis試劑(30%甲醛溶液0.2mL與10mL濃硫酸混合)產(chǎn)生不同顏色，可借以區(qū)別生物堿。但由于容易受雜質(zhì)干擾(如蛋白質(zhì)等)?，因此檢測結果不太準確。
二、定性分析
1、化學分析法
沉淀反應是生物堿理化鑒別常用的方法。常用的生物堿沉淀劑有碘-碘化鉀、碘化鉍鉀、碘化汞鉀、苦味酸、硅鎢酸等。多數(shù)沉淀反應是在酸性環(huán)境中進行，苦味酸等試劑可在中性條件下進行。用沉淀反應鑒別時需注意，中藥水浸出液中的蛋白質(zhì)、多肽和鞣質(zhì)等成分也可與生物堿沉淀試劑生成沉淀，產(chǎn)生假陽性從而導致鑒別結論錯誤。因此，由此法進行中藥中是否含生物堿類成分分析時，要先用適宜的方法處理樣品供試液，以排除雜質(zhì)類成分的干擾，避免產(chǎn)生假陽性。
2、色譜分析法
色譜分析法是檢視中藥中生物堿類成分常用的方法之一。包括薄層色譜法(TLC)?、紙色譜法(PC)?、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)?。
(31)薄層色譜法(TLC) 吸附劑常用硅膠或氧化鋁。供試品溶液的制備要根據(jù)被測成分的特點(如存在狀態(tài)、理化性質(zhì)及共存成分的性質(zhì)等)?，選用適宜的溶劑和方法進行提取、純化精制。展開劑多為三氯甲烷、苯等弱極性有機溶劑，可根據(jù)被測成分的極性加入其他溶劑調(diào)整展開劑的極性大小，以達到滿意的分離效果。薄層色譜展開后，有色生物堿可直接日光觀察，有熒光的生物堿可在紫外光燈下觀察，絕大多數(shù)情況需進行顯色，常用的顯色劑是改良碘化鉍鉀試劑，有時也可用碘化鉍鉀顯色后再噴硝酸鈉試劑，可使樣品斑點顏色更明顯，易于觀察。當使用硅膠作吸附劑時，由于硅膠顯弱酸性，強堿性的生物堿在硅膠色譜板上能形成鹽，而使Rf值變小或出現(xiàn)拖尾、形成復斑等現(xiàn)象。因此在使用硅膠吸附薄層色譜時，通用堿性展開系統(tǒng)(如加入氨水等)或在堿性環(huán)境下(用氨蒸氣飽和平衡)進行展開。
(2)紙色譜法(PC) 紙色譜法可用于生物堿鹽或游離生物堿的鑒別。當鑒別生物堿鹽時，由于生物堿是以解離形式存在，極性較大，一般以濾紙中所含水分作為固定相，用正丁醇-乙酸-水(BAW)系統(tǒng)作為展開劑。
當生物堿以游離堿態(tài)存在時，常以甲酰胺等作為固定相，以甲酰胺飽和的親脂性有機溶劑，如苯、三氯甲烷或乙酸乙酯等作為展開劑。生物堿紙色譜的顯色劑與薄層色譜法顯色劑基本相同。
(3)高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法對結構十分相似的生物堿有良好的分離效果，用于生物堿類成分的鑒別時，具有快速、靈敏、微量等優(yōu)點。在一定的高效液相色譜條件下，各種生物堿都有一定的保留時間，可作為定性鑒別的依據(jù)，但多數(shù)情況下采用標準品對照定性。
(4)氣相色譜法(GC) 具有揮發(fā)性且對熱穩(wěn)定的生物堿(如麻黃堿、煙堿等)可用氣相色譜法進行鑒別，其定性依據(jù)與高效液相色譜法相同。
三、定量分析
生物堿類成分含量測定方法很多，常用的有酸堿滴定法、分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、氣相色譜法及毛細管電泳法。
1、酸堿滴定法
生物堿類成分的堿性使其可用酸堿滴定法進行定量分析。通常根據(jù)生物堿的堿性不同，選用水溶液酸堿滴定及非水溶液酸堿滴定兩種方法進行含量測定。游離生物堿多為親脂性，不溶于水，水溶液酸堿滴定法是先將生物堿溶于過量的標準酸溶液中(如0.01mol/LH2SO4溶液)?，再用標準堿溶液(如0.02mol/L NaOH溶液)回滴。指示劑可用溴酚藍、甲基紅、溴甲酚藍等，如《中華人民共和國藥典》2005年版中麻黃總生物堿的含量測定即采用此法。其他如顛茄、檳榔、苦參等的總生物堿也可用此法進行測定。由于大多數(shù)生物堿的堿性較弱，常用非水溶液酸堿滴定法。在非水溶液酸堿滴定法過程中多用冰醋酸為溶劑，0.1mol/L高氯酸標準溶液為滴定液，溴酚藍、酚酞為指示劑。鹽酸麻黃堿、鹽酸小檗堿、鹽酸川芎嗪等都可用非水溶液酸堿滴定法測定含量。
2、分光光度法
根據(jù)生物堿分子結構的不同，若生物堿類成分在紫外區(qū)有吸收，就可用紫外分光光度法對其進行定量分析。若生物堿類成分在可見區(qū)有吸收，或在可見區(qū)無吸收，但可通過加入一些試劑能顯色的生物堿類成分，均可用可見分光光度法測定，即比色法。
(1)紫外分光光度法
在紫外區(qū)有吸收的生物堿類成分，可在其最大吸收波長處測定，利用其吸收度與生物堿的量成正比的原理進行定量分析。如雷公藤總生物堿的測定波長為267nm，通過吸收系數(shù)法或?qū)φ掌穼φ辗ㄟM行定量計算。當其他共存成分有干擾時，也可采用分光光度法。
(2)比色法 用比色法測定生物堿類成分常用下列三類方法：①加酸性染料比色法;②與生物堿沉淀試劑產(chǎn)生有色沉淀，定量分離沉淀后，用適當溶劑溶解后比色，如苦味酸鈉比色法、雷氏銨鹽比色法等;③根據(jù)生物堿自身的性質(zhì)或分子中所含官能團與某些試劑反應生成的顏色進行比色，如異羥肟酸鐵比色法。
①加酸性染料比色法：在一定pH介質(zhì)下，生物堿可與H+結合成生物堿陽離子，而酸性染料在此條件下解離為相應陰離子，二者可定量地結合成有色離子對。此離子對經(jīng)有機溶劑定量提取，測定有機溶劑提取液的吸收度或再經(jīng)堿化后定量放出染料的吸收度，即可計算出生物堿的含量。加酸性染料比色法廣泛用于中藥中生物堿類成分的測定。如川芎、防己、百部、浙貝母和附子等總生物堿的含量測定。
②雷氏鹽比色法：雷氏鹽NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]在酸性介質(zhì)中可與生物堿類成分定量地生成難溶于水的有色生物堿雷氏鹽沉淀B[Cr(NH3)2(SCN)4]。含兩個或兩個以上氮原子的生物堿，則可與雷氏鹽進一步作用生成雙鹽、三鹽等沉淀。應用雷氏鹽比色法比色測定時應注意：a.雷氏鹽的水溶液在室溫下可分解，故需臨用臨配，沉淀反應在低溫條件下進行較好;b.雷氏鹽的丙酮或丙酮-水溶液的吸收值隨時間變化而有變化，故需快速測定。
③苦味酸鈉比色法：在弱酸性溶液或中性溶液中生物堿可與苦味酸定量生成苦味酸鈉沉淀，該沉淀可溶于氯仿等有機溶劑，也可以在堿性條件下解離釋放出生物堿和苦味酸用來進行含量測定。
④異羥肟酸鐵比色法：含有酯鍵結構的生物堿，在堿性介質(zhì)中加熱酯鍵水解，產(chǎn)生的羧基與鹽酸羥胺反應生成異羥肟酸，再與Fe3+生成紫紅色的異羥肟酸鐵，在波長530nm處有最大吸收，測其吸收值，即計算生物堿的含量。
3、薄層掃描法
薄層掃描法測定生物堿類成分的含量具有方便、快速的優(yōu)點，因而應用較廣。通常薄層掃描法測定時對供試液純度要求不是太高，但由于中藥中化學成分復雜，待測定成分含量一般較低，因此在層析前需進行純化處理，以提高其純度。采用薄層掃描法進行生物堿類成分含量測定時，所選用的吸附劑、展開劑及顯色劑與其定性鑒別相似，但要求要嚴格。生物堿類成分在薄層掃描時，多采用雙波長反射式鋸齒掃描，若被測成分本身具有熒光時，也可采用熒光掃描，如鹽酸小檗堿等。
4、高效液相色譜法
高效液相色譜法是生物堿類成分定量分析最常用的方法，尤其適用于單體生物堿成分的含量測定。根據(jù)生物堿類成分堿性強弱、存在形式不同，可選用吸附色譜法、分配色譜法及離子交換色譜法等，其中分配色譜法應用最多。在分配色譜法中，反相分配色譜在生物堿類成分的分析方面應用最為廣泛。反相高效液相色譜中多采用非極性化學鍵合固定相，如十八烷基鍵合相(簡稱ODS或C18)?、辛烷基鍵合相(簡稱C8)?。最常用的流動相為甲醇-水、乙腈-水等混合溶劑。正相高效液相色譜常用的固定相有極性化學鍵合相(如氰基柱)和原型硅膠。在單體生物堿成分分析時，多用原型硅膠為固定相，但其分離原理屬于液-固吸附色譜。硅膠柱的分離主要利用生物堿的堿性不同，與生物堿的p Ka值有關，而與生物堿親脂性的大小無關。正相高效液相色譜常用的流動相為：二氯甲烷(或三氯甲烷、乙醚、異丙醚、四氫呋喃、乙酸乙酯)-甲醇(或異丙醇)-氨水(約為流動相的1%)?。在流動相中加入氨是為了中和硅膠的弱酸性，從而避免拖尾現(xiàn)象。
5、氣相色譜法
氣相色譜法用于生物堿類成分的含量測定，只適用于有揮發(fā)性且熱穩(wěn)定的生物堿類成分。如麻黃堿、檳榔堿、苦參堿等。對揮發(fā)性生物堿成分進行氣相色譜分析時，供試品溶液在提取、純化過程要避免加熱，以防成分被破壞或揮發(fā)，最后需用三氯甲烷等親脂性強的有機溶劑為溶劑制備供試液。
6.毛細管電泳法
毛細管電泳法在中藥成分分析中的應用雖起步較晚，但發(fā)展迅速，在生物堿類成分分析中已有較多應用。生物堿能解離正電荷，根據(jù)生物堿類成分p Ka值的不同，可采用毛細管區(qū)帶電泳模式分離結構相似的生物堿。在分析時，除可根據(jù)生物堿類成分p Ka值的不同選擇緩沖液pH值外，還可根據(jù)結構上的細微差異適當加入一些試劑以增強選擇性和分離度。
發(fā)布于: 2025-03-27