液相色譜柱色譜柱活化
新的色譜柱活化，實際上是一個平衡的過程，活化之前必須查看包裝內(nèi)配套說明書，并按說明書上聯(lián)系方式，與供應(yīng)商核實色譜柱內(nèi)保存溶劑及推薦活化步驟，若無推薦步驟可參考如下活化步驟：
1. 反相柱活化流程：
?、偌状蓟蛞译鏇_洗20倍柱體積;
?、谌袅鲃酉嗪芯彌_鹽，用跟流動相中鹽相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗過渡，用量為20倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上;
?、廴袅鲃酉嗖缓彌_鹽，用流動相平衡色譜柱，用量為20倍柱體積或以上;
?、茏罱K到壓力基線平穩(wěn)，若不平穩(wěn)可延長平衡時間。
2. 正相柱活化流程：
2.1 保存溶劑為正相溶劑時：
若使用正相溶劑做流動相，可用正相流動相沖洗20倍體積。一般先用異丙醇沖洗50倍體積，可用0. 2mL/min流速，再用流動相(乙腈/水)平衡50倍體積。
2.2 保存溶劑為反相體系時：
若使用反相體系做流動相，使用反相溶劑沖洗20倍體積后即可使用。若使用正相體系做流動相先用異丙醇沖洗50倍體積，可用0. 2mL/min流速，再用正相流動相平衡50倍體積。
補(bǔ)充：
柱體積計算：
例：2. 5mLx-65%（沒有裝填的柱體積）=1. 5mL=1個柱體積
液相色譜柱的保養(yǎng)
1. 色譜柱應(yīng)輕拿輕放,避免碰撞振動，放置和歸還時，相應(yīng)上機(jī)人員應(yīng)確認(rèn)保存在合適的溶劑中,并確認(rèn)色譜柱兩端的堵頭已旋緊。
2. 色譜柱壓力升高時,應(yīng)按照“標(biāo)題三”步驟進(jìn)行維護(hù)，色譜柱維護(hù)應(yīng)在色譜柱檔案備注中注明。
3. 當(dāng)出現(xiàn)色譜柱峰高降低,峰寬加大或出現(xiàn)肩峰及柱效下降時。應(yīng)按照“標(biāo)題四”原則進(jìn)行色譜柱再生，色譜柱再生應(yīng)在色譜柱檔案備注中注明。
4. 當(dāng)色譜柱維護(hù)及再生后，柱效、柱壓仍然不滿足要求，則上報相關(guān)負(fù)責(zé)人，經(jīng)負(fù)責(zé)人評估后認(rèn)為確需報廢的應(yīng)在色譜柱檔案中做好報廢記錄，報廢后的色譜柱應(yīng)專門存放,以便將來可以利用其填料修復(fù)被嚴(yán)重污染的色譜柱。，
色譜柱柱壓上升
1.色譜柱柱壓上升原因分析
和柱壓相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板以及其后面1-2cm長度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：
1.1填料破碎和使用后有填料粉末生成
當(dāng)流動相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末時，會堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板
1.2顆粒物堵塞引起柱壓上升和對策
可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品（制樣時灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動相（溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運行和進(jìn)樣時鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。
水和緩沖鹽流動相內(nèi)生長的細(xì)菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。
1.3化學(xué)污染物引起柱壓上升和對策
來源同樣是樣品、流動相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染最普遍，特別是對復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。
像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測器一般對此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時表現(xiàn)為干擾峰、基線波動、斑點甚至負(fù)峰；保留能力中等的污染物，會被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動和基線緩慢漂移；對強(qiáng)保留的污染物，一般流動相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會逐步在柱頭累積，因此需采取沖洗維護(hù)。
2.色譜柱柱壓上升解決方案
2.1 首先判斷除色譜柱外儀器壓力是否正常，從柱溫箱卸下液相柱，原本接液相柱的位置換成液相兩通，走純水流動相，流速1mL/min，首先判斷儀器壓力是否正常（一般安捷倫儀器不會超過30bar，島津儀器一般不超過4. 0）。
2.2若使用保護(hù)柱，應(yīng)先排除是否保護(hù)柱的問題，可以先去掉或更換新的保護(hù)柱，檢查壓力和柱效的情況。
2.3若儀器除色譜柱外壓力正常，去掉保護(hù)柱后仍存在壓力高、柱效下降等問題時，首先斷開色譜柱子和檢測器的連接，將管線留在色譜柱末端，將其放入接收液體的燒杯中，用以下步驟沖洗色譜柱：
反向色譜柱：
先用不含緩沖液鹽的流動相沖洗〈水/有機(jī)相)，即90%純水/10%有機(jī)相（甲醇或乙腈，分析流速沖洗）；
50%純水/50%有機(jī)相（分析流速沖洗）；
純有機(jī)相（甲醇/乙腈，分析流速沖洗，如果柱效恢復(fù)，則無需下一步?jīng)_洗）；
75%乙腈/25%異丙醇（50%分析流速沖洗）；
100%異丙醇（異丙醇粘度較大，建議沖洗流速為分析流速五分之一，避免超壓）；
100％二氯甲烷（50%分析流速沖洗）；
100%正己烷（50%分析流速沖洗）；
100%異丙醇（使用正己烷后，在使用之前或恢復(fù)使用反相流動相之前必須用100%異丙醇進(jìn)行沖洗，必要時，流速可以再降低，但需要保證沖洗體積）；
乙腈（（先低流速0. 3mL/min沖洗，看壓力平穩(wěn)后，也就是異丙醇被逐漸替換除去，再適當(dāng)?shù)脑黾恿魉俚?mL/min， 需要注意壓力不要驟然升高，替換出異丙醇溶液，接上檢測器，再用流動相平衡色譜柱，進(jìn)標(biāo)樣測試峰型）。
每一步?jīng)_洗的目的：高水相沖洗殘留的緩沖鹽，避免后面沖洗有機(jī)相導(dǎo)致鹽析—過渡—純有機(jī)相沖洗反相保留較強(qiáng)的污染物—洗脫能力更強(qiáng)的流動相沖洗
注意：
每個步驟原則上沖洗10-20倍柱體積，可以根據(jù)實際情況適當(dāng)?shù)脑黾踊蛘邷p少；
?、?對于壓力上漲幅度較大或者柱效下降幅度較大（比如50%以上）的問題，且色譜柱粒徑大于1. 8um或1. 9um粒徑的色譜柱，建議直接進(jìn)行反沖處理，色譜柱后端不接檢測器，流出的流動相直接進(jìn)廢液,沖洗步驟相同。
甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長菌，使用時間不可超過3天
舉例：以4. 6*250*5um規(guī)格的PLus/XDB/SB-C18色譜柱為例，操作如下：
1. 90%水10%乙腈，流速1mL/min，沖洗體積：50mL （如果流動相或者樣品中水溶性成分或者鹽含量過高，可以適當(dāng)延長沖洗時間）；
2. 50%水50%乙腈，流速1mL/min，沖洗體積：25mL （過渡）
3. 100%乙腈，流速1mL/min，50mL （如果樣品或者污染物中反相保留的化合物含量過高，可以適當(dāng)延長沖洗時間）；
4. 75%乙腈/25%異丙醇，流速0. 5mL/min，沖洗25mL（過渡）；
5. 100%異丙醇 ，流速0. 3mL/min，50mL （以上兩步?jīng)_洗效果不佳的情況下，嘗試異丙醇沖洗）；
6. 100%正己烷，流速0. 5mL/min，沖洗25mL
7. 100%異丙醇，流速0. 3mL/min，沖洗25mL
8. 100%乙腈，流速0. 3mL/min~1 mL/min，沖洗25~50mL
附：對于蛋白質(zhì)污染反相色譜柱的清洗方法
蛋白污染： 三氟乙酸可以降低流動相的 pH，抑制酸性硅醇基的解離，同時可作為離子對試劑，與蛋白的結(jié)合，抑制 與硅膠基質(zhì)的次級作用，所以當(dāng)?shù)鞍孜廴旧V柱時，可考慮用以下方式?jīng)_洗： 流動相： A 0. 1%TFA， B 0. 1%TFA 乙腈 梯度： 30min B 由 10%上升至 100%，保持 10min 樣品： DMSO，進(jìn)樣量 20uL 流速：分析流速 以 DMSO 作為樣品，用梯度的方式?jīng)_洗色譜柱，建議重復(fù) 5 個循環(huán)。
正相色譜柱（暫時只針對氨基柱）：
100%乙腈，流速1mL/min，沖洗5倍柱體積
100%異丙醇，流速0. 3mL/min，沖洗5倍柱體積
50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗5倍柱體積
含0. 1%EDTA的水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗10倍柱體積
0. 2MoL醋酸銨水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗20倍柱體積
50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，沖洗5倍柱體積
100%乙腈，流速1mL/min，沖洗10倍柱體積，封存
色譜柱一般流速推薦：4. 6mm內(nèi)徑柱子，柱流速：1mL/min左右；3. 0mm內(nèi)徑柱子，柱流速：0. 5mL/min左右；2. 1mm內(nèi)徑柱子，柱流速：0. 2mL/min左右。（注意：不要超過色譜柱最高耐受壓力）
三、液相色譜柱再生
當(dāng)色譜柱柱壓正常，但色譜圖異常時，首先更換保護(hù)柱重新進(jìn)樣觀察色譜圖，若仍然異常則判斷為色譜柱柱效下降，需要進(jìn)行再生步驟。柱效下降在色譜圖上主要表現(xiàn)為6種，分別為峰形加寬變形、峰形變粗、嚴(yán)重拖尾、出現(xiàn)肩峰、峰尖分叉(雙峰)及峰形畸變，分別見圖1~圖6。這些異常往往導(dǎo)致無法準(zhǔn)確定量，對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性造成影響。
一般而言,前3種情形受到污染的情況比較輕微,經(jīng)過再生即可大大提高柱效。出現(xiàn)第4種峰形一般是由于色譜柱受污染較為嚴(yán)重,如果是發(fā)生在初期,通過再生清洗也能夠恢復(fù)大部分柱效,如果長時間未進(jìn)行處理,污染物與固定相已經(jīng)牢固結(jié)合,則不能通過再生進(jìn)行恢復(fù),而只能通過清除被污染的固定相來進(jìn)行修復(fù)了。出現(xiàn)第5種峰形一般是色譜柱柱頭塌陷所致。第6種情形是本應(yīng)為單一的色譜峰卻畸變?yōu)槎鄠€色譜峰,這是污染非常嚴(yán)重造成的。柱頭塌
陷和嚴(yán)重污染均不能通過再生恢復(fù)柱效,只能通過物理方法進(jìn)行修復(fù)。
再生原則如下：
( 1)反相柱的再生：采用甲醇：水=95：5( V：V) ,純甲醇、二氯甲烷等溶劑作流動相,順次沖洗，每種流動相經(jīng)色譜柱的量為20～30倍柱體積,然后再用相反順序沖洗色譜柱。
(2)正相柱的再生：順次用20~30倍柱體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷﹑甲醇作為流動相沖洗色譜柱,然后再以相反的順序沖洗色譜柱。由于異丙醇的黏度較大,沖洗時應(yīng)將流速調(diào)到0. 2 mL/ min ,以免柱壓過大沖壞色譜柱。
發(fā)布于: 2023-05-22